研究内容

抗体医薬代替品を取得するための人工分子ライブラリーの創製

ファージウィルスを使ってライブラリーペプチドを作るT7ファージディスプレイ法をもとに、人工分子をライブラリーペプチドだけに特異的に共有結合させて分子進化させることで、少量で長く効く新たな薬剤形態(モダリティー)を模索しています。 例えば、ガン細胞などの疾患に結合するように進化させたハイブリッド型人工中分子は、疾患治療につながると見込まれます。

★ 最近の研究成果

1.スッポン型中分子薬剤(中分子コバレントドラッグ)

副作用なく不可逆(永続)的に疾患関連白質のみを阻害する薬剤の探索システムを確立することで、薬剤投与を最小回数で済ませること(患者のQOL向上)を目的として、標的蛋白質だけに不可逆的に共有結合する中分子型共有結合性薬剤(middle-molecule covalent drug;ラボ内スラングで「スッポン型中分子」)の開発研究を行っています。

★スッポン型開発の歴史:
スッポン型は、アスピリンに始まり100年以上の長い歴史を持つ薬剤概念ですが、我々が「中分子コバレントドラッグ」の可能性を信じて実験を開始した2013年頃は、中分子はおろか低分子においてもコバレントドラッグの新規報告例は滅多にありませんでした。不可逆的に共有結合する生理活性物質は、薬(drug)というより毒(toxicophore)のイメージが強く、科学的根拠よりも「何となく怖いもの」という漠然とした理由で敬遠され続けていたのではないかと推測しています。我々は、もしも本当に標的以外への不可逆的結合(副作用)が問題となるのであれば、分子標的性を多点認識で極限まで高めればよいのではないかと考え、低分子ではなく中分子biologicsを薬剤モダリティーとして選び、これに注力してきました。

1-1. DNA型

世界初の概念である、DNA型共有結合性薬剤(DNA covalent drug)を提唱しました。

Tabuchi et al., Chem. Commun., 57, 2483-2486 (2021); doi: 10.1039/d0cc08109d.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33625415/

水中で、標的の蛋白質に共有結合で強く喰いついて二度と離れませんが、相補鎖を加えると任意のタイミングで「共有結合させたまま解毒」できるところもミソです。市販の化合物から1段階の教科書反応(SN2反応)で誰でも作れるFig 2aの新規化合物1がポイントであり、電気泳動とかLC-MSとか、学部でならっている古典的基礎実験だけで成り立っているシンプルな系が特徴の論文です。今から30年前でも十分実施・完結できる内容なのですが、ずっと見逃されてきたことの中に、全くの新しさが隠れていることを田淵君が見逃さずに発見しました。世の中も学術も複雑化しすぎていますが、基本とか基礎ってすごく大事だと、改めて思います。

1-2. ペプチド型

ライブラリーペプチドからの共有結合性薬剤の直接的取得

Y. Tabuchi, T. Watanabe, R. Katsuki, Y. Ito, and M. Taki*, Direct screening of a target-specific covalent binder: stringent regulation of warhead reactivity in a matchmaking environment, Chem. Commun., 57, 5378-5381 (2021), selected as a hot/cover article; https://doi.org/10.1039/D1CC01773J

ライブラリーペプチドからの共有結合性薬剤の間接的取得

S. Uematsu et al., Combinatorially Screened Peptide as Targeted Covalent Binder: Alteration of Bait-Conjugated Peptide to Reactive Modifier, Bioconjugate Chemistry, 29, 1866-1871 (2018).
Open repository :
https://uec.repo.nii.ac.jp/?action=pages_view_main&active_action=repository_view_main_item_detail&
item_id=8864&item_no=1&page_id=13&block_id=21

派生研究:蛋白質結合性ペプチドを光架橋させることで、蛋白質のどのサイトに結合したかがMS/MSで分かる、という内容です。
K. Yatabe et al., A Cysteine-reactive small photo-crosslinker possessing caged-fluorescence property: binding-site determination of a combinatorially-selected peptide by fluorescence imaging / tandem mass spectrometry, International Journal of Molecular Sciences, 19, 3682 (2018).
Open access:https://www.mdpi.com/1422-0067/19/11/3682

2.超分子性コアの分子進化

人工分子コアにアザクラウンエーテル誘導体を持たせたライブラリーを10BASEd-T法(後述)にて作製し、 これを用いてバイオパニングを行うことで、ガン関連蛋白質(Hsp90;後述)に結合する「クリプタンド」(人工かご状の多座配位子)の取得に成功しました。 クリプタンドのような超分子性リガンドを、金属抽出などの従来用途ではなく、 生体分子と特異的に強く結合させてこれを阻害させたのは本研究が初めてです。

K. Mochizuki, L. Matsukura, Y. Ito, N. Miyashita*, M. Taki*, Medium-firm drug-candidate library of cryptand-like structures on T7 phage: Design and selection of strong binder for Hsp90, Org. Biomol. Chem., in press (2020).

なお、この論文はOrg. Biomol. Chem.誌(2021.1月号)のcover articleに選ばれました。

修飾ペプチド、あるいは架橋ペプチドを作るという発想ではなく、 人工コアの存在を際立たせつつ、 これと周辺ペプチドとを共進化させることで標的特異性などを補うというスタンスで、 今後も様々な薬剤形態(モダリティー)を探索していきたいです。

☆ ラボ内での上記関連研究の歴史

ファージウィルス上での反応について:10BASEd-T法

様々なガンなどの疾患関連蛋白質にピッタリ結合させるためには、ペプチドのアミノ酸配列をシャッフルさせて分子構造に多様性を持たせ、その中からドンズバリの配列を選んでくる必要があります。 多様な分子構造をいっぺんに作る方法は幾つかありますが、その中で我々は、ファージウィルス(T7 phage virus)の表面にペプチドを作らせる既知の手法(phage display法)をとりました。この方法だと、一匹一匹の別々のウィルスに別々のペプチドを作らせることができ、10億種類くらいの多様性を持つペプチドの混ざりを誰でも簡単に作ることができます。

我々はごく最近、このT7ファージウィルス自体には一切反応せず、ウィルス上でシャッフルさせたペプチドの特定の位置だけに 人工分子を結合させる技術を世界ではじめて開発しました。ウィルス本体を「生かした」まま行う10BASEd-T法というこの技術は、市販の試薬を混ぜるだけで誰でもできる非常に簡単なものです。 (Fukunagaら, Mol. BioSyst., 9, 2988 (2013).)

ちなみに10BASEd-Tとは、Gp10-based-thioetherification(ファージ上Gp10蛋白質を利用したチオエーテル化)の略語で、電気通信大学発の化学技術として、通信用語(10BASE-T)をもじったパロディーで名付けました。 今時は、無線LANでインターネットをするのが主流ですが、一昔前は10BASE-T規格のインターネットケーブルを、PCにガチャと差し込んでインターネットをするのが主流でした。ガチャと差し込むだけで、誰もがインターネットできるシステムに、私はとても驚きました。
一方の10BASEd-Tは、市販の試薬とT7ファージウィルス(ライブラリー)とを混ぜるだけで、簡単にハイブリッド分子を作ることができます。約10億種類も人工ハイブリッド分子を作ったら、さすがにこの中の1種類くらいは、ガンにピッタリ結合するものが見つけてこれるんじゃないかな、というスタンスです。 実際、幾つかの癌関連蛋白質に対し特異的に結合するハイブリッド分子の取得にも成功しています。

ここで強調したいのは、我々は人工ペプチドを作りたいのではなく、合理的設計を行った人工分子コアを母骨格(主役)として、シャッフルさせたペプチド(脇役)の力を借りて少しでも完全な人工物に近づけたい、ということです。
我々はこれまでに様々な有機分子の合理的設計・合成を行ってきましたが、すべて「不完全」でした。つまり何ヶ月も何段階もかけて物を作っても、期待した物性(例えば特異的結合性)を出すことは非常に難しく、その度に振り出しに戻ってしまいます。
今回、「不完全」な人工分子コアのモデルとして、アスピリン(風邪薬)の誘導体を選び、風邪薬が標的とする蛋白質とはおよそ関係のない蛋白質(ストレプトアビジン)にも結合するよう、分子進化させてみました。
この風邪薬誘導体は、非常に小さい分子構造のなかに水素結合性ドナー・アクセプター・芳香環を持つため、「不完全」ながらも様々な蛋白質と潜在的に結合しうると考えたのです。この母骨格周りのペプチド配列を10BASEd-T法にて最適化したところ、ストレプトアビジンに強く結合しうる人工分子へと進化させることができました。もちろん、母骨格と周辺ペプチド配列とのどちらが欠けても、強く特異的な結合は見られませんでした。
今回は直感的に人工分子コアの設計をしましたが、コンピュータ計算をしたり、インターネット上の公共データベースからデータマイニングを行ったり、それら手法を組み合わせたりしてこれを行うことが可能です。コダワリをもって設計した「不完全」な人工分子コアを、10BASEd-T法にて、何とか「使えそうなもの」へと分子進化させたいのです。

詳しくは、以下のオープンアクセス(誰でも無料閲覧可能な)雑誌にて。
Yuuki Tokunaga, Yuuki Azetsu, Keisuke Fukunaga, Takaaki Hatanaka, Yuji Ito and Masumi Taki*, Pharmacophore generation from a drug-like core molecule surrounded by library peptide via the 10BASEd-T on bacteriophage T7, Molecules, 19(2), 2481-2496 (2014); doi:10.3390/molecules19022481 (2014)..
"http://www.mdpi.com/1420-3049/19/2/2481"

コダワリをもって設計した人工分子コアの分子進化に関する別の切り口として、クラウンエーテル類縁体を紹介します。
この手の化合物は、別の分子と相互作用することで「超分子」と呼ばれる複合体を形成することがあるのですが、実際にはなかなか思った通りには行きません。非常に親水性の高い化合物なので、生体分子との適合性は潜在的にあるはずなのですが、複雑な構造を持つ蛋白質などの生体分子と特異的に相互作用した、などの例はほとんど聞いたことがありませんでした。
そこで、10BASEd-T法にてクラウン類縁体を進化させてみました。約10億種類程度のクラウン類縁体ライブラリーの中から、Hsp90蛋白質に特異的に結合しうる超分子型リガンドをたった一つですが発見することができました。なおHsp90とは分子シャペロン蛋白質の一種で、様々な癌や病気にも関連していることから近年注目を浴びている蛋白質の一つです。超分子型リガンドの細胞内導入や生体内での安定性向上など、幾つかの課題は残されていますが、無機質な有機人工分子に命を吹き込み(生物の力をちょっとだけ借りて人工分子を進化させ)、水とアブラの関係だった生体高分子(蛋白質)と超分子化学とに接点を持たせられたのでは?、と考えています。

詳しくは、王立化学会速報誌にて。
K. Fukunaga, T. Hatanaka, Y. Ito, M. Minami, and M. Taki*, Construction of a crown ether-like supramolecular library by conjugation of genetically-encoded peptide linkers displayed on bacteriophage T7, Chem. Commun., 50, 3921-3923 (2014). (2014).
なお、この論文はChem. Commun.誌のinside cover articleに選ばれました。

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新規蛍光プローブの開発

[A] Turn-on type

1. 蛍光分子の周辺環境により蛍光色と強度が変わるsolvatochromic色素コアを先述の10BASEd-T法にて分子進化させることで、標的蛋白質に結合したときだけ蛍光色が黄色から青色に変わり、なおかつ蛍光強度が顕著に増大する光変調性人工分子の取得に成功しました。

M. Taki, H. Inoue, K. Mochizuki, J. Yang, Y. Ito, Selection of color-changing and intensity-increasing fluorogenic probe as protein-specific indicator obtained via the 10BASEd-T, Anal. Chem., (2016); DOI: 10.1021 / acs.analchem.5b04687.

2. 前述した1のsolvatochromic色素コアによく似た構造の「caged型色素コア」を新規に合成し、solvatochromic色素コアの代わりに付け替えました。この人工分子を用いて、標的蛋白質に結合させた後に光を照射すると、uncageされて蛍光性を回復すると同時に、標的蛋白質の特定の位置に共有結合します;このように蛋白質結合性人工分子を光架橋させることで、蛋白質のどのサイトに結合したかを質量分析法にて決定しています。

K. Yatabe, M. Hisada, Y. Tabuchi & M. Taki*, A Cysteine-reactive small photo-crosslinker possessing caged-fluorescence property: binding-site determination of a combinatorially-selected peptide by fluorescence imaging / tandem mass spectrometry, International Journal of Molecular Sciences (IJMS), 19, 3682 (2018). "https://www.mdpi.com/1422-0067/19/11/3682" (Open access)

[B] Keep-on type

シッフ塩基型の低分子化合物ライブラリーを作製してセレクション(標的との結合試験)を行うことで、標的蛋白質と結合して疎水環境下に入ったときだけ蛍光を保持し、結合しなかった時には水中で加水分解すること蛍光を失う「keep-on型」結合体の概念を確立しました。シッフ塩基型の蛍光物質は「水中」で容易に加水分解して蛍光性を示さなくなるため、生体物質のセンシングには不向きと言われていましたが、この性質を逆手に取った研究です。

Y. Tabuchi & M. Taki*, Fluorescent 'keep-on' type pharmacophore obtained from dynamic combinatorial library of Schiff bases, Analytical and Bioanalytical Chemistry (ABC), 410, 6713-6717 (2018); DOI: 10.1007/s00216-018-1303-4.

[C] FRET type

分子サイズが小さくても可視光で励起可能な、光退色されづらい新規蛍光性アミノ酸をこれまでに開発しています。ペプチド自動合成機を用いて様々なペプチドの任意の位置に副反応なく導入できるアミノ酸は、渡辺化学工業より市販されており、FRETドナー(D)またはアクセプター(A)として使用できます。
http://www.watanabechem.co.jp/php/For_user_inspection.php?catalog=M020451

FRETペアとしての使用例:M. Taki*, Y. Yamazaki, Y. Suzuki, M. Sisido, Introduction of a highly photodurable and common-laser excitable fluorescent amino acid into a peptide as a FRET acceptor for protease cleavage detection, Chem. Lett., 39, 818-819 (2010).

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PETイメージングによる疾患の超早期発見

ペプチドや蛋白質の特定の部分に、様々な人工分子を迅速かつ定量的に導入する酵素化学的手法(NEXT-A反応)を世界で初めて開発しました。この反応を使い、疾患だけに集まるペプチドや蛋白質に放射線診断の目印となる物質を導入することで、ガンなどの超早期発見技術の確立を目指しています。これまで知られているPETイメージング用放射性アミノ酸(O-(2-fluoromethyl)-L-tyrosine (FMT); O-(2-fluoroethyl)-L-tyrosine (FET))の導入速度をきちんと調べてみたところ、【人工物質】であるFMTの導入速度が【天然物】であるフェニルアラニンの導入速度と殆ど変わらないことが分かりました。天然の酵素をだまして、人工物(PETイメージング用の目印物質)をこれほど素早くペプチドや 蛋白質に結合させる反応は、これまでに報告がありません。つまりNEXT-A反応は、人工物(PETイメージング用の目印物質) をペプチドや蛋白質に共有結合させる、(現時点で)【世界最速の酵素反応】と言えます。 (M. Taki* et al., Unexpectedly fast transfer of positron-emittable artificial substrate into N-terminus of peptide/protein mediated by wild-type L/F-tRNA-protein transferase, Amino Acids, 47, 1279-1282 (2015).)

NEXT-A反応とは?:種々の人工分子を蛋白質やペプチドの特定の末端部分だけに高効率・迅速(数分〜20分程度)に 共有結合させる化学酵素学的反応手法。反応に関わる3つの生体触媒分子は大腸菌を用いて大量に合成できるので、ミリグラム〜グラムスケールでの蛋白質やペプチドの修飾も可能。
★ 様々なペプチドや蛋白質など(biologicsといいます)に対するPETプローブ修飾法について、 我々の化学酵素学的手法(NEXT-A反応)および、他研究グループによる化学修飾法などをまとめて総説にしました。 (K. Arimitsu, H. Kimura, Y. Arai, K. Mochizuki, and M. Taki*, 18F-Containing PET Probe Conjugation Methodology toward Biologics as Specific Binders for Tumors, Current Topics in Medicinal Chemistry, in press (2016)).
★ PETプローブ修飾だけにとどまらず、NEXT-A反応を使うことによって既存の蛋白質や抗体などに対して様々な人工機能化が可能です。幾つかの企業と協同研究の形でこれを行っています。

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中分子biologics薬剤の体内安定性の向上:NEXT-A反応によるbiologics-Fc結合体作製

中分子biologics(例:ペプチド型または核酸型医薬品など)は、標的特異性が高い反面、生体内に入れた時に数時間以内で直ぐになくなってしまうことが玉にキズです。これらbiologicsと、「ヒト型抗体のFc領域」と呼ばれる分子量約7万の糖タンパク質とを結合することで、この問題が解決できると言われていましたが、Fcがあまりにも複雑な構造をしている高分子であるため、これらを効率良く1:1で結合させることは困難でした。我々は味の素鰍ニの共同研究で、前述したNEXT-A反応を応用して、FcのN末端と様々なbiologicsとをほぼ100%の変換効率で副反応なく共有結合できることを発見しました。
biologics-Fcの1:1結合体をネズミに投与した動物試験の結果、biologicsの生体内での薬理活性がきちんと保たれていることはもとより、3日たっても安定に体内に存在することも確認しております。抗体医薬品代替物としての期待が高まっている中分子biologicsは、今後も国内外で薬剤効果を持つものが次々と発見されると思われますが、本技術を用いることで、それらをヒトの体内においても安定に保つ形態に変換しつつ、薬剤の投与量を減らすことに貢献できるのでは?と考えています。
本研究成果はBioconjugate Chemistry誌(アメリカ化学会)に総合論文として採択されました。

Hirasawa S* (味の素, 兼, 瀧研D3), Kitahara Y, Okamatsu Y, Fujii T, Nakayama A, Ueno S, Ijichi C, Futaki F, Nakata K, and Taki M*, Facile and Efficient Chemoenzymatic Semi-Synthesis of Fc-Fusion Compounds for Half-Life Extension of Pharmaceutical Components, Bioconj. Chem., 30, 2323-2331 (2019); doi: 10.1021/acs.bioconjchem.9b00235.
この論文は:
1) Bioconjugate Chemistry誌(2019年9月号)のfront cover articleに選ばれました。
2) 共同通信(ほか)にてメディア報道がなされました。https://kyodonewsprwire.jp/release/201905276808
3) 本学量子科学研究センターHP http://www.ias.uec.ac.jp/ および、本学オンライン雑誌UEC e-Bulletin http://www.ru.uec.ac.jp/e-bulletin/research-highlights/2019/convenient-synthesis-of-biopharmaceutic-fc-conjugates.html にて取りあげていただきました。
(上記掲載に当たり、Sandhu先生や清水様らには大変お世話になりました;この場を借りて御礼申し上げます。)

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張力に応じて蛍光色の変わるヒドロゲル(生体向け複合材料)

「伸縮で蛍光色の変わる生体適応ゲル」を自前で基礎開発しました。慶応大の山下先生や、ETHチューリッヒ校(スイス)のVogel先生との共同研究です。細胞の張力を蛍光顕微鏡等でイメージングすることを目的として、研究を行っています。細胞や臓器にかかる力と生物学的現象との関係を見つけるための基礎研究ツールとして、今回の材料などを役立てたいです。指圧とかロミロミとか、局所圧迫からくる癌化とか、肩こりとか、今の科学で分からないことが分かったり、将来的には薬による治療を力による治療に置き換えられると良いな、と思っています。

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